在日常生活中，植物彷彿是大自然中最普遍的存在。然而，在這看似平凡的植物體內，究竟是如何運作以維持生命的呢？隨著科技日新月異，科學家正運用前所未有的精密工具，深入挖掘植物的奧秘，以理解植物的構造與生長機能。在這神秘的領域中，了解植物蛋白磷酸化的過程成為解開植物生命秘密的關鍵之一。這些微小的蛋白質，透過精細的磷酸化修飾，調控著植物的生長、應對壓力等重要生理過程。當我們好奇地探究是什麼讓植物能夠如此快速且靈活地適應各種環境時，了解植物蛋白的磷酸化過程就成為解開這個奧秘的鑰匙。
蛋白質體學是研究生物體內所有蛋白質的科學領域，研究範疇包括蛋白質的種類、數量、蛋白質間的交互作用，以及轉譯後修飾等。所謂的「轉譯後修飾」（post-translational modifications）是指蛋白質在其合成完成後，在細胞內經歷的後續修飾過程，常見的修飾類型之一即是「磷酸化」（phosphorylation）。而植物磷酸化蛋白質體學是一門深入研究植物內部所有蛋白質磷酸化過程的科學領域。在植物細胞中，蛋白質的磷酸化扮演著關鍵的角色，它是一種通過添加磷酸根基團調節蛋白質功能和活性的修飾過程。蛋白質磷酸化是高度動態的，以便在植物細胞內迅速地傳遞訊號。研究植物磷酸化蛋白質體不僅有助於解析植物細胞內部的信號網絡，還有助於得知植物如何感知並適應外部環境（如乾旱、極端溫度、鹽份）的變化。蛋白質磷酸化作為一種調控機制，影響著植物對養分、逆境、生長激素等刺激的感應和調控。因此，植物磷酸化蛋白質體學不僅有助於拓展我們對植物生物學的認識，更有望為未來改良作物、提高抗逆境能力等應用領域提供新的解方。
為了深入研究植物細胞中的磷酸化蛋白，科學家們借助質譜儀這種分析蛋白質體的先進主力工具，開啟了以質譜技術發展蛋白質磷酸化分析的嶄新篇章。這項技術的核心是利用質譜儀來鑑定蛋白質上的磷酸化位點，從而分析蛋白質哪些位置的氨基酸被磷酸化，進一步理解磷酸化如何影響此蛋白質的功能。要使用質譜儀鑑定蛋白質上的磷酸化位點，首先要將樣本中的蛋白質利用蛋白酶分解為較小的胜肽片段，接著將這些磷酸化胜肽片段富集後，導入質譜儀進行分析，通過質譜儀的高靈敏度和準確性，科學家們能夠定位的磷酸化位點。這樣的分析過程提供了對於植物在不同生理狀態下蛋白質磷酸化狀態的全面了解，有助於我們描繪出植物細胞內部複雜的磷酸化網絡產生的變化。
儘管質譜儀已成為系統性分析磷酸化的關鍵工具，然而磷酸化修飾胜肽的低豐度卻成為質譜檢測的阻礙。近期，由中研院植物暨微生物學研究所蛋白質體核心實驗室許全智博士團隊開發的一項新技術，稱為「串聯懸浮捕獲與固定金屬離子親和層析法」（tandem S-Trap-IMAC），能夠有效降底磷酸化蛋白質在樣品製備過程中的造成的損失，克服傳統方法的限制。串聯懸浮捕獲與固定金屬離子親和層析法技術的推出是基於懸浮捕獲（suspension trapping）的樣品前處理方法，它結合「懸浮捕獲微管柱」（S-Trap micro-column）與「鐵離子固定金屬離子親和層析微量滴管」（Fe-IMAC tip）。首先，此技術的運作程序是直接將懸浮捕獲微管柱載入至鐵離子固定金屬離子親和層析的滴管中，而無須額外處理步驟，實現了對植物細胞中的磷酸化胜肽的直接富集。與傳統的樣本處理步驟相比，這項技術省略了廢時的脫鹽、緩衝液交換等程序，縮短樣品製備所需時間，有效地提高了實驗分析通量。其次，相較於傳統蛋白質沉澱法中，蛋白質與植物色素分離步驟可能會導致樣本損失，新技術避免了此損失並提高了多重磷酸化胜肽的鑑定數目及定量精準度，展現了明顯的優勢。因此，串聯懸浮捕獲與固定金屬離子親和層析法技術的開發革新使其成為植物生物學研究的有力分析工具之一。
干擾雜質例如：光合作用色素、次級代謝物在懸浮補獲微量管柱沖洗步驟被移除，蛋白質在管柱內酶解成胜肽。磷酸化胜肽利用直接裝填策略進行純化，並利用液相層析串聯式質譜儀分析。
許全智博士研究團隊將串聯懸浮捕獲與固定金屬離子親和層析法技術進一步應用至分析阿拉伯芥幼苗的離層素（ABA，abscisic acid）磷酸化訊息信號。由於離層素在植物生長和應對環境壓力（缺水、缺養分等）中扮演著重要角色，因此研究離層素信號傳遞的變化有助於我們更深入地理解植物的適應機制。實驗同時對四個時間點（分別為0、10、30及60分鐘）上的核心離層素訊息傳遞酵素上的磷酸化位點進行了定量分析，結果顯示，60%早期離層素誘導的磷酸化胜肽是含有多重磷酸根，這表明它們在早期離層素訊息傳遞的重要性，也顯示蛋白質鄰近位點多重磷酸化可能在早期植物對於外部信號的快速適應中扮演了關鍵的角色。
A) 實驗流程示意圖。B) 對四個時間點識別的磷酸化位點進行主成分分析。
C) 在10、30和60分鐘的離層素處理後，單一和多重磷酸化的肽段被誘導增加的數目。
D) 在10、30和60分鐘的離層素處理後，單一和多重磷酸化的肽段被誘導下降的數目。
E) 離層素信號傳遞過程中，核心參與離層素訊息的酵素磷酸化位點按時間軸表達量改變的熱點圖。
串聯懸浮捕獲與固定金屬離子親和層析法技術的引入為植物蛋白質磷酸化分析帶來了一個全新的視野。這項技術的創新不僅在於其高通量的樣品處理方式，更在於提升了對多重磷酸化胜肽的鑑定數目和定量精準度。能夠直接且更全面地探索植物細胞中重要的磷酸化事件，這將有助於深入理解植物生物學的基本機制。
開發新穎分析方法是一場不斷尋找更好解方的冒險，而每一次的發現都如同找到了解開生命之謎的鑰匙一樣令人振奮。在這片綠色生命的微觀宇宙中，科學家們努力發展新穎的分析方法以揭開植物生長過程中的精彩故事，並為未來的農業改良、環境適應等領域提供更多的可能性。這個冒險將持續引領我們進入科學的奇蹟之中，繼續探索自然界的奧秘。
【延伸閱讀】
Chin-Wen Chen, Chia-Feng Tsai, Miao-Hsia Lin, Shu-Yu Lin, Chuan-Chih Hsu*
Suspension trapping-based sample preparation workflow for in-depth plant phosphoproteomics.
Anal. Chem., 2023,
⛓️doi.org/10.1021/acs.analchem.3c00786